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Source: bioSicherheit.de (GMO Safety

Optimising the biological safety of transgenic plants
"Marker-gene-free plants will soon be standard."

New and improved gene transfer methods are being developed throughout the world. The aim is to transfer only the target gene of interest. All sequences which are no longer required once transformation is complete, especially marker genes, are to be removed from the plant’s genome. Various safety research projects are also addressing this issue. In an interview with GMO Safety Professor Reinhard Hehl outlines the current state of play.

GMO Safety: Plant transformation methods are continually being refined. The key issues include greater efficiency, stable transgene integration and expression and, not least, marker gene elimination. Can you outline the current state of play? Where has progress been made, and where do you still see weaknesses?

Reinhard Hehl: T DNA transformation is a very precise method of transforming plants. Nowadays we can transfer the transgenes of interest far more accurately than was the case just 10 years ago. Advances have also been made in the development of special procedures to eliminate marker genes. In addition, we have considerably extended the spectrum of transformable plant species. In my view weaknesses arise where methods which have been well established in model plants either fail to function in agricultural crops, or function only suboptimally.

GMO Safety: Marker gene elimination is a particular focus of your research group. Are any approaches looking promising?

Reinhard Hehl: Yes - in future it will be possible to dispense with marker genes in plants of commercial interest. One particularly promising approach is co-transformation. The principle is based on the transfer of two separate T-DNAs, one carrying the transgene and the other the marker gene. The transgene and marker gene are introduced separately into the plant genome in such a way that they are integrated at different sites in the genome. This means there is very good chance that the transgene and the marker gene can be separated during cell meiosis, through recombination processes and that plant strains which carry only the transgene can then be selected. This method is already established and is without doubt the most widely used method of marker gene elimination in easily transformable plants.

GMO Safety: Are there any other ways to produce marker-gene-free plants?

Reinhard Hehl: There are two methods worth mentioning: one, which is based on the Cre/lox system, involves excising the marker gene from the genome by activating the recombinase genes which flank the marker gene. The other method, which my team is currently working on, uses the transposon system. We exploit a well-known plant phenomenon whereby genetic elements in the plant enable specific genes to ‘jump’ to a different genome section in the plant. We introduce a transgene and marker gene together using a T-DNA vector , then generate a transposition event which causes the transgene to reintegrate at a different site on the genome, thus separating from the marker gene. Here too, the marker-gene-free plants can be separated from the marker-gene-carrying plants in the subsequent generation. We have been able to demonstrate this in sugar beet. It works, provided that the transposon system used functions efficiently in the plant species being transformed.To sum up, we can say that, thanks in part to the research group, methods of removing marker genes from transgenic plants are now available.

GMO Safety: Segregation is the final step in all the methods of marker gene elimination you have mentioned. In other words, marker-gene-free strains can be selected only in the subsequent generation. That makes the procedure very time-consuming, doesn’t it?

Reinhard Hehl: Yes - even today we spend a great deal of time identifying the transgenic marker-gene-free plants in the subsequent generation. But there are smarter research methods for obtaining marker-gene-free plants much more quickly. For example, we can dispense with the crossing stage and therefore the subsequent segregation altogether. Instead, marker-gene-free offspring are obtained from the haploid pollen of plants which have previously been successfully co-transformed.

If the target gene and marker gene are integrated on different chromosomes during co-transformation, some pollen carrying only the target gene will be produced after pollen cell division. Following artificial diploidization of the haploid chromosome set, plants carrying only the target gene can be regenerated from these pollen cells. This approach is being pursued further In a research project at the Institute of Plant Genetics and Crop Plants Research (IPK) in Gatersleben.

GMO Safety: The methods you describe, particularly co-transformation, seem to be on the verge of practical application. Are there any safety concerns?

Reinhard Hehl: The co-transformation method is ready for practical application. However, new transgene integration sites are created for each transgenic plant, and these must all undergo individual safety assessment. It must be ensured that no mutations occur at the transgene integration site and also that transgene expression takes place in the desired form.

GMO Safety: In view of the development of transgenic plants containing new and modified plant substances, such as substances of commercial or pharmaceutical interest for example, procedures are being developed to limit the ability of these plants to spread - essentially sterilisation methods. How close to practical implementation are these procedures?

Reinhard Hehl: These so-called confinement methods make sense when applied to plants which outcross easily, such as oilseed rape and certain types of cereal. The production of male-sterile plants is one biotechnological approach currently being pursued. Our research group is working on metabolic-physiological sterility, in which the pollen cells cannot metabolise carbohydrates . This inhibits pollen development, resulting in the production of male sterile plants. The results are encouraging, but the technique is not yet ready to put into practice. Chloroplast transformation, which prevents genes expressed in the chloroplast from being transferred to other plants via pollen, is a major topic of future interest.

GMO Safety: If you were to draw up a list of all the unresolved issues surrounding the optimisation of gene transfer methods, where would you focus research during the coming years?

Reinhard Hehl: The refinement of sequence-specific integration will be at the forefront, as demonstrated by the recent call for tenders from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) for safety research on transgenic plants. Genes should be integrated only where we want them. In other words at specific sites in the genome which have previously been well characterised. This means excluding undesirable mutations and the ensuring optimum expression of the transgene at its integration site.

GMO Safety: Thank you for talking to us.

Quelle: bioSicherheit.de (GMO Safety)

Marker-gene-free plants will soon be standard

Weltweit wird an neuen und verbesserten Gentransfer-Methoden gearbeitet. Angestrebt wird, nur noch das jeweilige Zielgen zu übertragen. Alle nach Abschluss der Transformation nicht mehr benötigten Sequenzen - vor allem Markergene - sollen aus dem Genom der Pflanzen wieder entfernt werden. Auch verschiedene Projekte der Sicherheitsforschung beschäftigen sich damit. Im Gespräch mit bioSicherheit zieht Prof. Reinhard Hehl eine Zwischenbilanz.

bioSicherheit: Die Methoden zur Transformation von Pflanzen werden laufend weiterentwickelt. Höhere Effizienz, stabile Integration und Expression der Transgene und nicht zuletzt die Eliminierung von Markergenen sind dabei wichtige Fragestellungen. Können Sie eine Zwischenbilanz ziehen? Wo wurden Fortschritte erzielt, wo sehen Sie noch Schwächen?

Reinhard Hehl: Für die Transformation von Pflanzen steht uns die T‑DNA Transformation als ein sehr präzises Verfahren zur Verfügung. Die gewünschten Transgene können wir heute wesentlich präziser als noch vor 10 Jahren übertragen. Fortschritte wurden auch bei der Entwicklung spezieller Methoden zur Markergen-Eliminierung gemacht. Außerdem konnte das Spektrum an transformierbaren Pflanzenarten wesentlich erweitert werden. Schwächen sehe ich dort, wo Methoden, die in Modellpflanzen gut etabliert wurden, in Nutzpflanzen nicht oder nur suboptimal funktionieren.

bioSicherheit: Die Markergen-Eliminierung nimmt einen besonderen Forschungsschwerpunkt in Ihrem Verbund ein. Gibt es erfolgversprechende Ansätze?

Reinhard Hehl: Ja - in Zukunft wird es möglich sein auf Markergene in den zu kommerzialisierenden Pflanzen zu verzichten. Ein sehr erfolgversprechender Ansatz ist die Co-Transformation. Das Prinzip beruht darauf, dass mit zwei getrennten T-DNAs transformiert wird, bei der die eine T-DNA das Transgen trägt und die andere das Markergen. Transgen und Markergen werden also getrennt voneinander in das pflanzliche Genom übertragen und integrieren folglich auch an unterschiedlichen Stellen im Genom. Auf diese Weise sind die Chancen sehr hoch, dass das Transgen und das Markergen später über Rekombinationsvorgänge während der Reifeteilung der Zellen getrennt und anschließend Pflanzenlinien selektiert werden können, die nur noch das Transgen tragen. Diese Methode ist bereits etabliert und sicher die am häufigsten angewendete Methode zur Markergen-Eliminierung bei gut transformierbaren Pflanzen.

bioSicherheit: Gibt es noch weitere Methoden Markergen-freie Pflanzen zu erzeugen?

Reinhard Hehl: Da sind vor allem zwei Methoden zu erwähnen. Die eine Methode – auf Basis des Cre/lox-Systems - beruht darauf, das Markergen aus dem Genom wieder "herauszuschneiden". Dies geschieht über Rekombinase-Gene, die das Markergen flankieren und gezielt aktiviert werden. Die andere Methode – daran arbeitet meine Arbeitsgruppe – benutzt das Transposon -System. Wir nutzen hier ein bekanntes Phänomen bei Pflanzen. Es gibt genetische Elemente in der Pflanze, die bestimmte Gene zum "Springen" in einen anderen Genomabschnitt der Pflanze verhelfen. Wir führen Transgen und Markergen über einen T-DNA-Vektor gemeinsam ein, erzeugen dann ein Transpositionsereignis, so dass das Transgen an einer anderen Stelle des Genoms wieder integriert und auf diese Weise vom Markergen getrennt wird. Auch hier können dann in der Folgegeneration die Markergen-freien von den Markergen-tragenden Pflanzen getrennt werden. Das konnten wir am Beispiel der Zuckerrübe zeigen. Voraussetzung dafür ist allerdings, dass das eingesetzte Transposon-System in der zu transformierenden Pflanzenart effizient funktioniert.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es heute, auch Dank des Forschungsverbundes, Methoden gibt, Markergene aus transgenen Pflanzen zu entfernen.

bioSicherheit: Bei allen von Ihnen erwähnten Methoden der Markergen-Eliminierung muss sich als letzter Schritt die Segregation anschließen. D.h. erst in der Folgegeneration können Markergen-freie Linien selektiert werden. Das macht die Verfahren zeitaufwändig.

Durch Mikroinjektion wurde DNA in Zwiebelzellen eingeschleust. Das Genprodukt ist durch die blaue Farbe nachweisbar. Nur die Zelle im Zentrum wurde injiziert. Durch kleine Zell-Verbindungskanäle gelangte das Genprodukt auch in die umgebenen Zellen. Quellenangabe: Dr. Michael Knoblauch, Universität Gießen / www.biosicherheit.de

Reinhard Hehl: Ja - wir müssen heute noch einen sehr großen Aufwand betreiben, die transgenen Markergen-freien Pflanzen in der Folgegeneration zu identifizieren. Es gibt aber clevere Forschungsansätze, um wesentlich schneller zu Markergen-freien Pflanzen zu kommen. Beispielsweise – in dem man auf den Kreuzungsschritt und damit die Segregation ganz verzichtet. Stattdessen werden Markergen-freie Nachkommen aus den haploiden Pollen zuvor erfolgreich co-transformierter Pflanzen gewonnen.

Wenn bei der Co- Transformation Zielgen und Markergen auf unterschiedlichen Chromosomen integrieren, werden nach der Pollenzellteilung auch Pollen gebildet, die nur noch das Zielgen tragen. Nach der künstlichen Verdopplung des haploiden Chromosomensatzes können anschließend aus diesen Pollenzellen Pflanzen regeneriert werden, die nur noch das Zielgen tragen. Dieser Ansatz wird in einem Forschungsprojekt am IPK in Gatersleben weiterverfolgt.

bioSicherheit: Die Methoden, insbesondere die Co-Transformation scheint nahe einer praktischen Anwendung zu sein. Sind Sicherheitsbedenken zu berücksichtigen?

Reinhard Hehl: Für die praktische Anwendung der Co-Transformationsmethode fehlt nichts mehr. Allerdings werden bei jeder transgenen Pflanze neue Transgen-Integrationsorte erzeugt, die dann im Einzellfall einer Sicherheitsbewertung unterliegen. Es muss ja sichergestellt sein, dass an der Integrationsstelle des Transgens keine Mutationen entstehen und die Transgenexpression auch in der gewünschten Weise stattfindet.

bioSicherheit: Vor dem Hintergrund der Entwicklung transgener Pflanzen mit neuen und veränderten Inhaltsstoffen beispielsweise industriell nutzbarer und pharmazeutischer Substanzen wird an Methoden zur Begrenzung der Ausbreitungsfähigkeit – im Kern Sterilitätskonzepte – gearbeitet. Wie praxisreif sind diese Verfahren?

Mikroinjektion in Zellen eines Kartoffelkallus Quellenangabe: Dr.Michael Knoblauch, Universität Gießen / www.bioSicherheit.de

Reinhard Hehl: Solche Confinement-Methoden sind immer dann sinnvoll, wenn sie Pflanzen betreffen, die leicht auskreuzen können. Das sind zum Beispiel Raps und bestimmte Getreidearten. Die Erzeugung männlich steriler Pflanzen ist ein biotechnologischer Ansatz der verfolgt wird. Im unserem Forschungsverbund wird an einer stoffwechselphysiologischen Sterilität gearbeitet, bei der die Pollenzellen keine Kohlenhydrate metabolisieren können, dadurch wird die Pollenreifung gehemmt und die Pflanzen werden männlich steril. Die Ergebnisse sind vielversprechend, das Verfahren ist aber noch nicht praxisreif. Ein in Zukunft wichtiges Thema wird die Chloroplasten -Transformation sein, die zur Folge hat, dass Gene, die im Chloroplasten exprimiert werden, nicht durch Pollen auf andere Pflanzen übertragen werden.

bioSicherheit: Wenn Sie ein Resümee über die noch offenen Fragen einer Optimierung von Gentransfermethoden ziehen, wo sollte in den nächsten Jahren die Forschung intensiviert werden?

Reinhard Hehl: Im Vordergrund - und das zeigt auch die neue Ausschreibung des BMBF zur Sicherheitsforschung bei transgenen Pflanzen - wird die Weiterentwicklung der sequenzspezifischen Integration stehen. Gene sollen nur dort integrieren, wo wir sie haben wollen. Das heißt in spezifischen vorher gut charakterisierten Stellen im Genom. Dazu gehört, dass unerwünschte Mutationen ausgeschlossen werden und dass das Transgen an seiner Integrationsstelle optimal exprimiert wird.

bioSicherheit: Vielen Dank für das Gespräch.
 

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