Washington, DC, USA
April 21, 2011
A new procedure devised by U.S. Department of Agriculture (USDA) scientists and colleagues can improve polymerase chain reaction (PCR)-based methods of detecting plant disease organisms.
PCR-based tests are prized tools for diagnosing plant diseases that can cause yield losses and diminished markets among other economic harm. But the test's ability to obtain a "genetic fingerprint" conclusively identifying a culprit pathogen hinges on there being a minimum number of its cells. Otherwise, the pathogen's genetic material can't be probed and multiplied in amounts necessary for detection, explains plant pathologist Norm Schaad, formerly with USDA's Agricultural Research Service (ARS). ARS is USDA's principal intramural scientific research agency.
Such diagnostic shortcomings can be especially costly when asymptomatic seed or plants intended for sale are certified as pathogen-free when, in fact, they are not, adds Schaad. He worked at the ARS Foreign Disease-Weed Science Research Unit in Frederick, Md., prior to retiring last year.
To tackle the problem, Schaad and colleagues Nikolas Panopoulos and Efstathios Hatziloukas devised a preliminary step called Bio-PCR. It uses growth-promoting agar or liquid media to increase the number of a target organism's cells in a sample prior to amplification of genetic material. In four to 72 hours, depending on the pathogen, the cells make thousands of new copies, enabling detection by direct PCR, according to Schaad.
Besides increasing sensitivity by 100- to 1,000-fold over conventional PCR methods, the enrichment technique stops substances called inhibitors from interfering with the action of a key enzyme, Taq polymerase.
Bio-PCR works best with fast-growing bacteria such as Ralstonia solanacearum, which causes bacterial wilt of potato and tomato, and Acidovorax avenae, which causes bacterial fruit blotch of watermelon. However, Bio-PCR also improves detection of slow-growing pathogens such as Xylella fastidiosa, responsible for Pierce's disease of grapes and leaf scorch of shade trees.
In studies with X. fastidiosa, Bio-PCR detected the bacterium in 90 percent of infected grape samples compared to 13 percent with conventional PCR methods.
Read more about this research in the April 2011 issue of Agricultural Research magazine.
Photo: ARS-developed seedless variety, Autumn Royal. Photo by Bob Nichols.
Nuevas técnicas mejoran las pruebas de PCR para detectar los patógenos
Un nuevo procedimiento desarrollado por científicos del Servicio de Investigación Agrícola y sus colegas puede mejorar la capacidad de métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) de detectar los organismos que causan las enfermedades de plantas.
Las pruebas basadas en PCR son herramientas valiosas para diagnosticar las enfermedades de plantas que pueden causar pérdidas de rendimientos y otros daños económicos. Pero la capacidad de la prueba de obtener una "huella dactilar genética" que identifica definitivamente el culpable depende de la disponibilidad de una cantidad suficiente de las células del patógeno. Sin estas células, no es posible probar y multiplicar el material genético del patógeno en las cantidades suficientes para detección, según patólogo de plantas Norman Schaad, anteriormente con el ARS. ARS es la agencia principal de investigaciones científicas del Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA por sus siglas en inglés).
Tales deficiencias diagnósticas pueden ser especialmente costosas cuando se venden como libres de patógenos las plantas y semillas que sí están infectadas pero no demuestran síntomas, según Schaad. Él trabajó en la Unidad de Investigación de Enfermedades Extranjeras y la Ciencia de Malezas mantenida por el ARS en Frederick, Maryland, antes de su jubilación.
Para abordar este problema, Schaad y sus colegas Nikolas Panopoulous y Efstathios Hatziloukas crearon un paso preliminar llamado Bio-PCR. Este paso usa un agar para promover el crecimiento o un medio líquido para aumentar el número de células de un organismo en una muestra antes de amplificar el material genético. Dentro de cuatro a 72 horas, dependiendo del patógeno, las células producen miles de nuevas copias, facilitando la detección del patógeno por la PCR directa, según Schaad.
Además de aumentar la sensibilidad de la prueba hasta 1.000 veces comparada con los métodos tradicionales de PCR, esta técnica de enriquecimiento previene injerencia en el proceso por sustancias llamadas inhibidores que pueden parar la acción de una enzima clave llamada Taq polimerasa.
Bio-PCR funciona mejor con las bacterias que crecen rápidamente, tales como Ralstonia solanacearum, la cual causa la marchitez bacteriana de la papa o del tomate, o Acidovorax avenae, la cual causa la marchitez bacteriana de la sandía. Sin embargo, Bio-PCR también mejora la detección de los patógenos que crecen más lentamente, tales como Xylella fastidiosa, la cual causa la enfermedad de Pierce en las uvas y las hojas quemadas en los árboles de sombra.
En estudios con X. fastidiosa, Bio-PCR detectó la bacteria en el 90 por ciento de las muestras infectadas de uvas, comparada con el 13 por ciento detectado con los métodos convencionales de PCR.
Lea más sobre esta investigación en la revista 'Agricultural Research' de abril del 2011.
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