Germany
July 12, 2023
Scientists at Leipzig University, in collaboration with colleagues at Vilnius University in Lithuania, have developed a new method to measure the smallest twists and torques of molecules within milliseconds. The method makes it possible to track the gene recognition of CRISPR-Cas protein complexes, also known as “genetic scissors”, in real time and with the highest resolution. With the data obtained, the recognition process can be accurately characterised and modelled to improve the precision of the genetic scissors. The results obtained by the team led by Professor Ralf Seidel and Dominik Kauert from the Faculty of Physics and Earth Sciences have now been published in the prestigious journal Nature Structural and Molecular Biology.
The central question of the project was whether the unwinding of a piece of DNA that is only 10 nanometres long could be tracked in real time. Photo: Colourbox
When bacteria are attacked by a virus, they can defend themselves with a mechanism that fends off the genetic material introduced by the intruder. The key is CRISPR-Cas protein complexes. It is only in the last decade that their function for adaptive immunity in microorganisms has been discovered and elucidated. With the help of an embedded RNA, the CRISPR complexes recognise a short sequence in the attacker’s DNA. The mechanism of sequence recognition by RNA has since been used to selectively switch off and modify genes in any organism. This discovery revolutionised genetic engineering and was already honoured in 2020 with the Nobel Prize in Chemistry awarded to Emmanuelle Charpentier and Jennifer A. Doudna.
Occasionally, however, CRISPR complexes also react to gene segments that differ slightly from the sequence specified by the RNA. This leads to undesirable side effects in medical applications. “The causes of this are not yet well understood, as the process could not be observed directly until now,” says Dominik Kauert, who worked on the project as a PhD student.
Nanoscale processes tracked in detail
To better understand the recognition process, the team led by Professor Ralf Seidel and Dominik Kauert took advantage of the fact that the DNA double helix of the target sequence is unwound during recognition to enable base pairing with the RNA. “The central question of the project was therefore whether the unwinding of a piece of DNA that is only 10 nanometres (nm) long could be tracked in real time at all,” says Kauert.
To observe the unwinding process in detail, the scientists had to make it visible to the microscope. To achieve this goal, the team drew on the achievements of DNA nanotechnology, which can be used to create any three-dimensional DNA nanostructure. Using this so-called DNA origami technique, the researchers constructed a 75 nm long DNA rotor arm with a gold nanoparticle attached to its end. In the experiment, the unwinding of the 2 nm thin and 10 nm long DNA sequence was transferred to the rotation of the gold nanoparticle along a circle with a diameter of 160 nm – this movement can be magnified and tracked using a special microscope setup.
With this new method, the researchers were able to observe the sequence recognition by the CRISPR Cascade complex almost base pair by base pair. Surprisingly, base pairing with the RNA is not energetically advantageous, meaning that the complex is only unstably bound during sequence recognition. Only when the entire sequence is recognised does stable binding occur and the DNA is subsequently destroyed. If it is the “wrong” target sequence, the process is aborted.
Findings may help in selecting suitable RNA sequences
The fact that the recognition process sometimes produces incorrect results is due to its stochastic nature, i.e. to random molecular movements, as the researchers have now been able to demonstrate. “Sequence recognition is driven by thermal fluctuations in base pairing,” says Kauert. With the data obtained, it was possible to create a thermodynamic model of sequence recognition that describes the recognition of deviating sequence segments. In the future, this should allow better selection of RNA sequences that recognise only the desired target sequence, thus optimising the precision of genetic manipulation.
As the designed nanorotors are universal in their suitability for measuring twists and torques in single molecules, they can also be used for other CRISPR-Cas complexes or biomolecules.
The work was funded by the European Research Council and the German Research Foundation and carried out in collaboration with the research group of Professor Virginijus Siksnys from Vilnius University in Lithuania, who isolated and provided the CRISPR complexes used.
The researchers constructed a DNA rotor arm and attached a gold nanoparticle to its end in order to observe the movements during DNA unwinding. Photo: Dominik Kauert
Original title of the publication in Nature Structural and Molecular Biology:
“The energy landscape for R-loop formation by the CRISPR-Cas Cascade complex”
, doi: doi.org/10.1038/s41594-023-01019-2
Created by: Nina Vogt / Translation: Matthew Rockey
Neue Methode ermöglicht genaue Beobachtung der Generkennung - Physiker:innen machen Aktivität von CRISPR-Genscheren sichtbar
Wissenschaftler:innen der Universität Leipzig haben in Zusammenarbeit mit Kolleg:innen der Universität Vilnius in Litauen eine neue Methode entwickelt, um kleinste Verdrehungen und Drehmomente von Molekülen innerhalb von Millisekunden zu messen. Die Methode ermöglicht es, die Generkennung von CRISPR-Cas-Proteinkomplexen, auch „Genscheren” genannt, mit höchster Auflösung in Echtzeit zu verfolgen. Mit den gewonnenen Daten kann der Erkennungsprozess genau charakterisiert und modelliert werden, um die Präzision der Genscheren zu verbessern.
Die Ergebnisse des Teams um Prof. Dr. Ralf Seidel und Dominik Kauert von der Fakultät für Physik und Geowissenschaften wurden jetzt in der renommierten Fachzeitschrift „Nature Structural and Molecular Biology“ veröffentlicht.
Wenn Bakterien von einem Virus befallen werden, können sie sich mit einem Mechanismus dagegen wehren, der das eingeschleuste Erbgut des Eindringlings abwehrt. Der Schlüssel dazu sind CRISPR-Cas-Proteinkomplexe. Deren Funktion als adaptive Immunsysteme in Mikroorganismen wurden erst im letzten Jahrzehnt entdeckt und aufgeklärt. CRISPR-Komplexe erkennen die Angreifer mit Hilfe einer integrierten RNA an einer kurzen Sequenz in deren DNA und zerstören sie dann. Der Mechanismus der Sequenzerkennung mit Hilfe einer RNA wurde in der Folge genutzt, um Gene in beliebigen Organismen gezielt auszuschalten und zu verändern. Diese Entdeckung revolutionierte die Gentechnik und wurde bereits 2020 mit dem Nobelpreis für Chemie an Emmanuelle Charpentier und Jennifer A. Doudna gewürdigt.
Hin und wieder reagieren CRISPR-Komplexe aber auch auf Genabschnitte, die von der durch die RNA vorgegebene Sequenz leicht abweichen. Das führt bei medizinischen Anwendungen zu unerwünschten Nebenwirkungen. „Die Ursachen dafür sind noch nicht gut verstanden, da der Prozess bisher nicht direkt beobachtet werden konnte“, sagt Dominik Kauert, der als Doktorand an dem Projekt arbeitete.
Prozesse auf Nanoebene im Detail verfolgt
Um den Erkennungsprozess besser zu verstehen, machte sich das Team um Prof. Dr. Ralf Seidel und Dominik Kauert und zunutze, dass die DNA-Doppelhelix der Zielsequenz während der Erkennung entwunden wird, um die Basenpaarung mit der RNA zu ermöglichen. „Die zentrale Frage des Projekts war daher, ob sich das Entwinden eines nur 10 Nanometer (nm) langen DNA-Stücks überhaupt in Echtzeit verfolgen lässt“, sagt Kauert.
Um den Entwindungsprozess im Detail beobachten zu können, mussten die Wissenschaftler:innen ihn für das Mikroskop erfassbar machen. Dafür griff das Team auf den Werkzeugkasten der DNA-Nanotechnologie zurück, mit der sich beliebige dreidimensionale DNA-Nanostrukturen erstellen lassen. Mit Hilfe dieser so genannten DNA-Origami-Technik konstruierten die Forscher:innen einen 75 nm langen DNA-Rotorflügel und befestigten an dessen Ende einen Goldnanopartikel. Die Entwindung der 2 nm dünnen und 10 nm langen DNA-Sequenz übertrug sich im Experiment auf die Rotation des Goldnanopartikels entlang eines Kreises mit einem Durchmesser von 160 nm – diese vergrößerte Bewegung konnte in einem speziellen Mikroskopaufbau verfolgt werden.
Mit dieser neuen Methode konnten die Wissenschaftler:innen die Sequenzerkennung durch den CRISPR-Komplex Cascade nun nahezu Basenpaar für Basenpaar beobachten. Überraschend war dabei, dass die Basenpaarung mit der RNA energetisch kaum von Vorteil ist, so dass der Komplex während der Sequenzerkennung nur labil gebunden ist. Erst, wenn die gesamten Sequenz vollständig erkannt wurde, kommt es zu einer stabilen Bindung und in der Folge zur Zerstörung der DNA. Handelt es sich um die „falsche“ Zielsequenz, wird der Prozess hingegen abgebrochen.
Ergebnisse können künftig bei der Auswahl passender RNA-Sequenzen helfen
Dass der Erkennungsprozess dennoch manchmal fehlerhafte Ergebnisse liefert, ist auf dessen stochastische Natur, nämlich auf zufällige Molekülbewegungen, zurückzuführen, wie die Forscher:innen jetzt nachweisen konnten. „Die Sequenzerkennung wird durch thermische Fluktuationen bei der Basenpaarung angetrieben,“ so Kauert. Mit den gewonnenen Daten konnte ein thermodynamisches Modell der Sequenzerkennung erstellt werden, das die Erkennung von abweichenden Sequenzabschnitten beschreibt. Dies soll in Zukunft eine bessere Auswahl von RNA-Sequenzen ermöglichen, die nur die gewünschte Zielsequenz erkennen, um die Präzision genetischer Manipulationen zu optimieren.
Da die konstruierten Nanorotoren universell für die Messung von Verdrehungen und Drehmomenten in einzelnen Molekülen geeignet sind, können sie auch für andere CRISPR-Cas-Komplexe oder Biomoleküle eingesetzt werden.
Die Arbeiten wurden vom Europäischen Forschungsrat und von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert und in Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Virginijus Siksnys von der Universität Vilnius (Litauen) durchgeführt, die die verwendeten CRISPR-Komplexe isoliert und zur Verfügung gestellt hat.
Originalpublikation:
Nature Structural and Molecular Biology:
„The energy landscape for R-loop formation by the CRISPR-Cas Cascade complex”, https://doi.org/10.1038/s41594-023-01019-2
Topics
Species
